GPC/SEC-Theorie: Dreifachdetektion
Dreifachdetektion setzt den Maßstab für die heutige GPC/SEC-Technologie und hat sich zum bevorzugten Verfahren für die Charakterisierung natürlicher sowie synthetischer Polymere und Proteine entwickelt. Sie verwendet einen Konzentrationsdetektor, ein Viskosimeter und einen Lichtstreudetektor, die miteinander zusammenwirken, wobei jeder Detektor komplementäre, aber verschiedene Informationen liefert:
- Der Lichtstreudetektor dient der direkten Messung des absoluten Molekulargewichts ohne dass eine aufwändige Säulenkalibrierung durchgeführt werden muss.
- Der Viskositätsdetektor ermöglicht die direkte Messung der Grenzviskosität bzw. der molekularen Dichte und ermöglicht die Bestimmung der molekularen Größe, Konformation und Struktur.
- Die Konzentration wird mit einem RI-Detektor oder einem UV-Spektrometer gemessen und ist für die Bestimmung sowohl des Molekulargewichts als auch der Grenzviskosität wichtig.
Die Dreifachdetektion versetzt uns in die Lage, all dies und mehr ohne das Erfordernis einer zeitraubenden Säulenkalibrierung zu bewältigen Mit einem einzigen eng verteilten Standard können die Instrumentenkonstanten der Detektoren bestimmt und Berichtigungen hinsichtlich der Auswirkungen der Inter-Detektor-Verschiebung und Inter-Detektor-Peakverbreiterung durchgeführt werden. Die Peakverbreiterungsparameter sind für gute GPC/SEC-Ergebnisse mit mehreren Detektoren entscheidend. Die mit der OmniSEC-Software durchführbaren Berechnungen beruhen auf über 20 Jahre Erfahrung und Optimierung dieser Parameter.
Der einzigartige Vorteil der Dreifachdetektion besteht darin, dass man damit das absolute Molekulargewicht, die Molekülgröße (bis kleiner als 1 nm) und die Grenzviskosität sowie Informationen über die Konformation, Verzweigung und Aggregation in einem einzigen GPC/SEC-Versuch erhalten. Es ist das einzige Detektionsverfahren, das in der Lage ist, diese ungemein reiche Datensammlung online in einem Durchflussmodus zu liefern.
Die Molekulargewichtsdaten können mit Informationen über beispielsweise die Verzweigung und den hydrodynamischen Radius kombiniert werden, um einen eindeutigen Hinweis auf die Struktur der Probe und ihre Molekulargewichtsverteilung zu erhalten.
Bei der Dreifachdetektion wird das Molekulargewicht direkt mit Hilfe des Lichtstreudetektors bestimmt.
Zur Bestimmung des Molekulargewichts verwenden alle handelsüblichen Lichtstreudetektoren die Rayleigh-Gleichung, die einfach besagt, dass die Streulichtstärke einer optischen Konstante mal der Konzentration mal dem Molekulargewicht entspricht.
Nach der Rayleigh-Gleichung muss die Streulichtstärke bei einem Winkel von null Grad gemessen werden. Da für solch eine Messung erforderlich wäre, dass wir direkt in den einfallenden Strahl hineinschauen, was nicht möglich ist, muss die Lichtstärke bei einem Winkel von null Grad geschätzt werden, und es gibt im Wesentlichen drei verschiedene Möglichkeiten, um dies zu tun:
- Messung der Lichtstreuung bei einem sehr kleinen Winkel (LALS). Bei Winkeln von 10 Grad oder kleiner wird der Fehler minimiert und kann vernachlässigt werden.
- Messung der Lichtstreuung bei mehreren Winkeln und Extrapolation auf Null (MALS). Dies erreichen wir durch Auftragung des Lichtstreusignals als eine Funktion des Winkels.
Mit beiden Methoden erhalten wir genaue Daten zum Molekulargewicht für kleine Moleküle, wie z.B. Proteine, deren Streulicht keine Winkelabhängigkeit aufweist. Jedoch wird bei diesen kleinen Molekülen vorzugsweise eine empfindlichere Messung bei 90 Grad durchgeführt (Lichtstreuung bei rechtem Winkel, RALS).
Bei großen Molekülen ist die LALS-Messung die einfachste und theoretisch beste Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts. Beim LALS-Ansatz wird die Streulichtstärke bei kleinstmöglichem Winkel (7 Grad) gemessen, wodurch Fehler aufgrund der Winkelabhängigkeit ausgeräumt werden, ohne auf die Datenanpassung oder eine Extrapolation der Messdaten zurückgreifen zu müssen.
Beim Mehrfwinkelansatz müssen die Daten von 2 oder mehr Winkeln zur Schätzung des Molekulargewichts auf einen Winkel von null Grad extrapoliert werden. Wenn die Moleküle groß sind, ist die Extrapolation nichtlinear, und die Daten müssen vor ihrer Extrapolation auf einen Winkel von null Grad an eine gewählte nichtlineare Funktion angepasst werden. Die Qualität dieser Anpassung und Extrapolation ist für die Genauigkeit des geschätzten Molekulargewichts von entscheidender Bedeutung. Daten von Mehrwinkelmessinstrumenten werden häufig mit einer Unsicherheit (+/-) angegeben, aber diese ist nur die Unsicherheit der Anpassung; Hinweise auf die tatsächliche Genauigkeit der Molekulargewichtsdaten werden nicht geliefert.
Eine übliche Ergänzung zum Dreifachdetektionssystem ist das UV/Vis-Spektrometer, das als ergänzender Konzentrationsdetektor zum Einsatz kommt.
Das so entstandene Vierfachdetektionssystem erweitert den Informationsgehalt. Da wir zwei Konzentrationsdetektoren haben, besteht die Möglichkeit, das Molekulargewicht von Copolymeren und konjugierten Proteinen sowie die Anzahl der über die Verteilung anwesenden Comonomere zu bestimmen.
Zudem ermöglicht uns ein UV-Detektor, das Molekulargewicht zu berechnen, wenn sowohl die Konzentration als auch das Brechungsindexinkrement (dn/dc) unbekannt sind. Dies ist oft der Fall, wenn wir uns mit Proteinen befassen. Wenn wir den Extinktionskoeffizienten des Proteins kennen, besteht die Möglichkeit, seine Konzentration mit Hilfe des UV-Detektors zu bestimmen.
Bei bekannter Konzentration besteht dann die Möglichkeit, das Brechungsindexinkrement (dn/dc) mit Hilfe des RI-Detektors zu ermitteln, wonach alle Parameter zur Bestimmung des Molekulargewichts zur Verfügung stehen.
GPC/SEC-Systeme:
Das Viscotek TDAmax ist ein vollständiges, temperaturgesteuertes und fortschrittliches GPC/SEC-Multidetektorsystem, das sich für alle makromolekularen Anwendungen eignet, insbesondere in der Forschung. Es besteht aus drei einzigartigen und komplementären Komponenten – die Drei- oder Vierfachdetektionsreihe (TDA), das GPCmax-integrierte Lösungsmittel- und Probenabgabemodul und die OmniSEC-Software.
Das Viscotek 270max ist ein modulares und fortschrittliches Multidetektorsystem, das bei Raumtemperatur arbeitet. Es eignet sich ideal für die vollständige routinemäßige Charakterisierung natürlicher und synthetischer Polymere, Copolymere und Proteine.
Das Viscotek RImax ist ein modulares und konventionelles Kalibriersystem. Es ist einfach zu handhaben und kann vollständig auf eine weitergehende Detektionsfähigkeit erweitert werden. Zudem ist es für die routinemäßige GPC/SEC und für Lehrzwecke ausgelegt. Es funktioniert mit der gleichen leistungsstarken OmniSEC-Software, die auch bei den fortschrittlichen Systemen zum Einsatz kommt.
Weitere informationen
Application communication: Determination of polymer structure by GPC Es ist vorteilhaft, Molekulargewichte mit Hilfe der Lichtstreuung zu bestimmen, wenn die Signale ausreichend stark sind. Dreifachdetektion kombiniert die Detektionsfähigkeiten in einem einzigen System, das so in der Lage ist, das Molekulargewicht und die Molekülstruktur zu bestimmen.
On-demand presentation: Polysaccharide characterization by triple detection Bei der Größenausschlusschromatographie dient die Dreifachdetektion zur Charakterisierung von Polymerverteilungen. Polysaccharide sind natürliche Polymere, die mit diesem Verfahren gemessen werden können. Mit Hilfe der Dreifachdetektion können wir das Molekulargewicht sowie die molekulare Größe und Konzentration von Polysacchariden bestimmen, und erhalten Informationen über ihre Struktur. Dieses Webinar beschreibt das Verfahren und bietet einige Anwendungsbeispiele. Online-Präsentation starten: Polysaccharidcharakterisierung mittels Dreifachdetektion
On-demand presentation: Protein characterization by triple detection Bei der Größenausschlusschromatographie dient die Dreifachdetektion zur Trennung und Charakterisierung von Molekülen, wie z.B. Proteine. Mit Hilfe der Dreifachdetektion kann man das Molekulargewicht und die Molekülgröße eines Proteins unabhängig voneinander und unabhängig von der Retentionszeit berechnen. Dieses Webinar beschreibt das Verfahren und liefert einige Beispielanwendungsdaten.
Kostenlose Registrierung
Zugriff auf Applikation-Notes, Webinars, Videos und mehr.
Jetzt registrieren
